【產(chǎn)品名稱】

通用名稱： 豬圓環(huán)病毒 2 型(PCV-2)核酸檢測試劑盒(PCR 法)

Name ：Porcine Circovirus type II Detection Kit (PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預期用途】

豬圓環(huán)病是由豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus）引起豬的一種傳染性、先天性顫抖和斷奶仔豬多系統(tǒng)功能障礙性疾病。該病毒具有 PCV1 和PCV2 兩種血清型， PCV1 無致病性。PCV2 具有很強的免疫抑制作用，臨床上常表現(xiàn)為多病原混合感染，PCV2 與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）密切相關(guān)，還可引起豬皮炎與腎炎綜合征、呼吸道綜合征和 A2 型先天性震顫等疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。因此PCV2 感染早期診斷尤為重要。

本試劑盒適用于檢測從肺、淋巴結(jié)組織、全血等標本中分離出的豬圓環(huán)病毒 2 型 DNA，用于豬圓環(huán)病毒 2 型的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對豬圓環(huán)病毒 2 型特異性引物，對豬圓環(huán)病毒 2 型 DNA 進行體外擴增檢測，用于科研實驗中對可疑感染者的病原學檢測。

【試劑組成】

名稱規(guī)格

PCV-2 反應液550μL×2 管

PCV-2 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

注：

1）不同批號試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù)。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間

11 cycle94℃2min

2

35 cycles94℃30sec

58℃30sec

72℃60 sec

反應體系為 25μL；

5.電泳檢測

1)2%瓊脂糖凝膠配制：稀釋 50×TAE 緩沖液至 1×TAE (取 20mL 50×TAE 緩沖液， 加 980mL 雙蒸水至 1L)，稱 4g 瓊脂糖放于 500mL 錐形瓶中，1×TAE 緩沖液 200 mL，置入微波爐中加熱熔解(避免加熱沸騰溶液外溢)，再加入 10μL 染料充分混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后使用；

2)電泳：在電泳槽中加入 1×TAE 緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。用移液器取 10μ L PCR 擴增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠孔中。加樣后，以 5V/cm 電壓，電泳 20-30min（每次電泳時，每隔 10min 觀察一次。當加樣緩沖液中溴酚藍電泳過半至凝膠下 2/5 處時，可停止電泳）。電泳后，紫外燈下觀察結(jié)果。

6.結(jié)果判定

陽性質(zhì)控品出現(xiàn) 1154 bp 條帶，陰性質(zhì)控品不出現(xiàn)條帶或只出現(xiàn)片段較小的引物二聚體條帶，實驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn) 1154 bp 條帶，判斷為陽性，否則為陰性。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融不超過 5 次，有效期 12 個月。

【所需儀器】

PCR 儀、電泳儀、紫外凝膠成像儀等

【標本采集】

病死或撲殺的豬，取肺、淋巴結(jié)等組織；待檢活豬，用注射器取血 5mL

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標

本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中； 全血樣本：待血凝固后，取血清放于離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清 100 μL 于滅菌離心管中

1.2DNA 提取

采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請

按照試劑盒說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

試劑PCV-2 反應液

用量（樣本數(shù)為 N）21μL

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間

11 cycle94℃2min

2

35 cycles94℃30sec

58℃30sec

72℃60 sec

反應體系為 25μL；

5.電泳檢測

1)2%瓊脂糖凝膠配制：稀釋 50×TAE 緩沖液至 1×TAE (取 20mL 50×TAE 緩沖液， 加 980mL 雙蒸水至 1L)，稱 4g 瓊脂糖放于 500mL 錐形瓶中，1×TAE 緩沖液 200 mL，置入微波爐中加熱熔解(避免加熱沸騰溶液外溢)，再加入 10μL 染料充分混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后使用；

2)電泳：在電泳槽中加入 1×TAE 緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。用移液器取 10μ L PCR 擴增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠孔中。加樣后，以 5V/cm 電壓，電泳 20-30min（每次電泳時，每隔 10min 觀察一次。當加樣緩沖液中溴酚藍電泳過半至凝膠下 2/5 處時，可停止電泳）。電泳后，紫外燈下觀察結(jié)果。

6.結(jié)果判定

陽性質(zhì)控品出現(xiàn) 1154 bp 條帶，陰性質(zhì)控品不出現(xiàn)條帶或只出現(xiàn)片段較小的引物二聚體條帶，實驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn) 1154 bp 條帶，判斷為陽性，否則為陰性。

7.產(chǎn)品性能指標

試劑靈敏性 10-3 以上，特異性 100%，批間批內(nèi)差異≤3%。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全   通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]許立華, 蘆銀華等. 豬圓環(huán)病毒研究進展[J]. 中國病毒學, 2004, 19(3): 288-290.

[2]楊漢春. 豬免疫抑制性疾病的流行特點與控制對策[J].中國畜牧獸醫(yī), 2004.

[3]Wellenberg G, Pesch S, Berndsen F. Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of postweaning multi- systemic wasting syndrome in Netherlands [J]. Veterinary Quarterly, 2000, 22(3): 167-172.