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氨基酸(amino acid, AA)含量測定試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/3/30點擊次數(shù):515

氨基酸(amino acid, AA)含量測定試劑盒說明書

                                              微量法 100T/96S

                                                                  

   正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

動物肝臟、腎臟是氨基酸代謝的主要器官,故尿中氨基酸的變化最能反應(yīng)肝、腎的生理狀態(tài)。另外,氨基酸還能反應(yīng)灼傷、傷寒等方面情況。植物體內(nèi)氨基酸含量對研究植物在不同條件下及不同生長發(fā)育時期氮代謝變化、植物對氮素的吸收、運輸、同化及營養(yǎng)狀況等有重要意義。

 

測定原理:

氨基酸的α -氨基可與水合茚三酮反應(yīng),產(chǎn)生藍紫色化合物,在570 nm有特征吸收峰;通過測定570 nm吸光度,來計算氨基酸含量。

 

自備儀器及用品:

臺式離心機、水浴鍋、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、無水乙醇、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體×1瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×1瓶(棕色),4℃避光保存。臨用前加入667μL無水乙醇,蓋緊后充分混勻,再加入9.333 mL蒸餾水混勻,避光保存。

試劑四:粉劑×1管,4℃避光保存。臨用前加1 mL蒸餾水,充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)品:粉劑×1瓶,臨用前加10 mL蒸餾水,充分溶解。1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液,4℃避光保存。

 

樣品中AA提取:

1.        按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行室溫勻漿,然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP 管中,蓋緊后(防止水分散失)置于沸水浴提取15 min;自來水冷卻后,8000g4離心10min,上清液置冰上待測。

2.        細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g4離心10min,取上清,置冰上待測。

3.        血清等液體:直接檢測。

測定操作:

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到570 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管:EP管,加入10μL蒸餾水,100μL試劑二,100μL試劑三和10μL試劑四,混勻后蓋緊瓶蓋(防止水分散失),置于沸水浴中保溫15 min,冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次,于570nm測定吸光值,記為A空白管。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測完。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管:EP管,加入10μL標(biāo)準(zhǔn)品,100μL試劑二,100μL試劑三和10μL試劑四,混勻后蓋緊瓶蓋

 

(防止水分散失),置于沸水浴中保溫15 min,冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次,于570nm測定吸光值,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測完。

4. 測定管:EP管,加入10μL上清液,100μL試劑二,100μL試劑三和10μL試劑四,混勻后蓋緊瓶蓋(防止水分散失),置于沸水浴中保溫15 min,冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次,于570nm測定吸光值,記為A測定管。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測完。

注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測定一次。

 

氨基酸含量計算公式:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按蛋白濃度計算

氨基酸含量(μmol /mg prot= [C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定-A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)]÷V×Cpr

=1×(A測定-A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白) ÷Cpr

2)按樣本質(zhì)量計算

氨基酸含量(μmol /g 鮮重=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定-A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)] ÷V樣總÷V樣)÷W

=1×(A測定-A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白) ÷W

3)按細胞數(shù)量計算

氨基酸含量(μmol /104 cell=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)] ×V樣總÷V×細胞數(shù)量)

=1×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷細胞數(shù)量

4)按照液體體積計算

氨基酸含量(μmol /mL=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]÷V

=1×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品濃度,1 μmol/mLV標(biāo)準(zhǔn)品:反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積,0.01 mLW:樣品質(zhì)量,gV樣:反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積,0.01 mLV樣總:樣品提取液總體積,1mLCpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1)按蛋白濃度計算

氨基酸含量(μmol /mg prot=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定-A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)] ÷V×Cpr

=1×(A測定-A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白) ÷Cpr

2)按樣本質(zhì)量計算

氨基酸含量(μmol /g 鮮重=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定-A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)]×V樣總÷V樣)÷W

=1×(A測定-A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白) ÷W

3)按細胞數(shù)量計算

氨基酸含量(μmol /104 cell= [C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)] ×V樣總÷V×細胞數(shù)量)

=1×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷細胞數(shù)量

4)按照液體體積計算

氨基酸含量(μmol /mL=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]÷V

=1×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

 

 

C標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品濃度,1 μmol/mLV標(biāo)準(zhǔn)品:反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積,0.01 mLW:樣品質(zhì)量,gV樣:反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積,0.01mLV樣總:樣品提取液總體積,1mLCpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL

 

注意事項:

1. 試劑盒中試劑三、試劑四和標(biāo)準(zhǔn)品均需臨用前配制,且避光保存,配制好未使用完的4℃保存且3天內(nèi)使用完畢

2. 為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,需先取1-2個樣做預(yù)實驗,如果測定的吸光值過高(高于2.5),用蒸餾水稀釋后再測定。

3. 脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)在570nm處無吸收峰,因此,570nm處測定結(jié)果不含這兩種氨基酸的量。

4.最di檢出限為100μmol/L

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